La Gambrinus liga 2000/01 fue la octava edición de la Gambrinus liga, la máxima categoría del fútbol profesional de la República Checa. El torneo se comenzó a disputar el día 28 de julio del 2000 y finalizó el 25 de mayo de 2001. El AC Sparta Praga se adjudicó el campeonato por séptima vez en su historia, la quinta de manera consecutiva.